生活中發(fā)生腰痛很常見。隨著現(xiàn)代生活壓力增加，很多人不注意腰部保健。腰部損傷可以使椎間盤老化退變或小關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂、椎間隙變窄等，其中髓核（NP）退變是導(dǎo)致椎間盤退行性變（IVDD）和腰痛的主要原因，但潛在的分子機制和細胞異質(zhì)性尚不清楚。

本期，小編就來介紹一下蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄒俊老師研究團隊（澳大利亞新南威爾士大學(xué)涂計博士，李文甜博士，澳大利亞昆士蘭大學(xué)楊思東博士，共同第一作者）發(fā)表在Advanced Science(IF=16.802)上的文章，題目為Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression。這篇文章利用單細胞測序等技術(shù)，揭示了髓核在椎間盤退行性變中的發(fā)生進程。

烈冰生物參與了本次單細胞測序?qū)嶒灪蛿?shù)據(jù)分析工作，下面請跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結(jié)果分析吧~

# 樣本信息 #

8個不同級別的IVDD患者的NP組織樣本，患者詳細信息如下：

# 主要技術(shù)手段 #

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，

實時熒光定量技術(shù)，免疫組化技術(shù)，免疫熒光技術(shù)，流式細胞分選術(shù)，細胞培養(yǎng)技術(shù)等。

# 捕獲平臺 #

BD Rhapsody

# 研究結(jié)果 #

1. 髓核細胞（NPCs）亞型鑒定及分析

首先，作者利用單細胞測序技術(shù)，從八名不同級別的IVDD患者中分別分離出NP組織，總共獲得39732個細胞。研究者利用marker gene判定分析，鑒定出6個主要的細胞亞型，分別為肥大軟骨細胞樣NPCs（HT-CLNPs），效應(yīng)NPCs（effector NPCs），穩(wěn)態(tài)NPCs（homeostatic NPCs），監(jiān)管NPCs(regulatory NPCs)，纖維NPCs（fibroNPCs），粘附 NPCs（adhesion NPCs）。另外，Ⅱ級IVDD患者中主要是HT-CLNPs和regulatory NPCs，Ⅲ和Ⅳ級主要是HT-CLNPs和effector NPCs，Ⅴ級主要是fibroNPCs和adhesion NPCs。最后作者利用實時熒光技術(shù)和免疫組化技術(shù)進行了驗證，結(jié)果與單細胞分析數(shù)據(jù)一致。

2. IVDD患者的轉(zhuǎn)錄組差異

接下來作者分析了不同級別IVDD患者的轉(zhuǎn)錄本信息，鑒定出了一系列與退行性程度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（LMX1A、PRDM1、REL等）。隨后，作者利用差異表達基因分析，GO Pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)了與IVDD發(fā)展級別相關(guān)的基因（HSPH1、CTGF、MMP13、HSP90AA1），在重度IVDD患者中熱休克蛋白基因（HSPA1B、HSPH1、HSP90AA1等）顯著上調(diào)，說明了stress-related機制在IVDD中的重要性。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了一系列可能會引起退行性發(fā)生的通路，包括抗原加工和呈遞通路、TNF通路、MAPK通路及Hippo通路等。

3. 細胞亞群的轉(zhuǎn)錄組特征

基于已有研究：神經(jīng)支配，血管生成和細胞衰老與IVDD的發(fā)生相關(guān)。為了分析亞群之間的功能差異，作者利用GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在血管生成方面，fibroNPCs占比最高。而后作者利用QuSAGE分析、SCENIC分析，發(fā)現(xiàn)regulatory NPCs中高表達的基因（CXCL3、IL-6和CHI3L1）參與了細胞炎癥和內(nèi)源性刺激的反應(yīng)，表明該細胞亞型可能具有調(diào)節(jié)免疫的功能；homeostatic NPCs中與細胞內(nèi)平衡相關(guān)（翻譯調(diào)控和蛋白質(zhì)/RNA代謝）的基因高表達；adhesion NPCs具有細胞遷移和細胞基質(zhì)黏附作用；HT-CLNPs中與細胞周期阻滯和衰老相關(guān)的基因表達活躍，且鑒定了HT-CLNP-Ⅰ和HT-CLNP-Ⅱ，作者又利用擬時序分析揭示了HT-CLNP-Ⅰ和HT-CLNP-Ⅱ的演化進程。

4. fibroNPCs亞群的特征

接下來，作者研究了不同細胞亞群之間的關(guān)系并利用細胞軌跡重建分析揭示了細胞分化方向和細胞譜系軌跡。細胞間的分化順序為fibroNPCs、adhesion NPCs、effector NPCs、regulatory NPCs、HT-CLNP和homeostatic NPCs。另外，研究者利用scVelo軌跡分析發(fā)現(xiàn)，fibroNPCs具有分化成其他亞型細胞的潛力，是主要的終末期髓核細胞，表明fibroNPCs具有干細胞特性。進一步，基于細胞亞群劃分和基因表達情況，作者發(fā)現(xiàn)CD90在fibroNPCs中特異性表達，推測CD90+NPCs是fibroNPCs的主要干細胞群體。最后，作者利用實時熒光技術(shù)，細胞培養(yǎng)技術(shù)，染色技術(shù)，免疫熒光技術(shù)等驗證了fibroNPCs可促使NP退變。

5. NP衍生的G-MDSCs亞群的鑒定

在NP中除了有髓核細胞外，還有免疫細胞，作者共鑒定出了9種類型免疫細胞，包括單核細胞和巨噬細胞（marker為CD163），中性粒細胞（marker為FCGR3B (CD16b) 和 HLADR），GMPs細胞（marker為MS4A3, MPO, ELANE），NK細胞（marker為CD94），粒細胞性髓系源性抑制細胞（G-MDSCs　marker為ITGAM(CD11b), OLR1, ARG1）等。而后作者利用擬時序分析，預(yù)測了免疫細胞的分化方向是從GMPs，G-MDSCs到中性粒細胞。進一步，作者通過流式分選技術(shù)分離出CD45+CD11b+OLR1+ CD24+/-的G-MDSCs，發(fā)現(xiàn)輕度退行性NP組織中的G-MDSCs約是重度的3倍。在大鼠模型中利用免疫組化和免疫熒光進行驗證，也發(fā)現(xiàn)G-MDSCs在重度模型中的減少。

6. NP衍生的G-MDSCs功能驗證

基于上述研究結(jié)論，作者推測G-MDSCs細胞在IVDD病程發(fā)展中至關(guān)重要。隨后，作者通過流式分選技術(shù)分離出CD45+CD11b+OLR1+CD24+/-的兩群G-MDSCs，利用免疫抑制實驗和活性氧（ROS）檢測技術(shù)及細胞共培養(yǎng)等技術(shù)，對G-MDSCs的進行功能驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-MDSCs具有免疫抑制細胞和ROS產(chǎn)生的能力，其中CD24+的免疫抑制能力和ROS產(chǎn)生更強。另外有研究表明白細胞介素（IL-1β）可誘導(dǎo)髓核NP退行性發(fā)生。作者將G-MDSCs與NPCs共培養(yǎng)（加入IL-1β），發(fā)現(xiàn)聚集蛋白聚糖（髓核中主要的蛋白多糖）有所增加，而與退行性進程相關(guān)的基因（MMP13）表達下降，這表明G-MDSCs可緩解IL-1β介導(dǎo)的NPCs的退變。

7. IVDD中細胞間相互作用

最后，作者利用細胞通訊分析探究了細胞間的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細胞與其他類型細胞的相互作用最多，而NPCs間的相互作用最為活躍。對免疫細胞與退行性NPCs間的通訊網(wǎng)絡(luò)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，NPCs上的受體（FN1，F(xiàn)GF）與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細胞因子（TNF, IL-6, PDGF, TGFB等）存在相互作用。以上結(jié)果表明免疫細胞和NPCs在NP中的發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，例如炎癥平衡，細胞增殖和血管生成等。

結(jié)論

本研究中作者利用單細胞測序等技術(shù)，共鑒定了NPCs的6種細胞亞型，在分析各個亞型的潛在功能時，作者發(fā)現(xiàn)fibroNPCs（marker gene：CD90）是退行性NP組織中的干細胞，另外粒細胞G-MDSCs具有緩解椎間盤退行性發(fā)展的潛能。總之，該研究中揭示了NP的多種NPCs亞型的特征，為IVDD治療提供了新思路。

原文鏈接

https://doi.org/10.1002/advs.202103631