肝細胞癌（HCC）是最常見的肝惡性腫瘤，其進展與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)。免疫檢查點抑制劑治療（anti-PD-1 /anti-PD-L1）已經(jīng)成為晚期肝癌患者的一線治療方案。

然而，HCC患者長期受炎癥刺激可能會使其免疫微環(huán)境發(fā)展為對免疫治療耐藥的狀態(tài)。事實上，大多數(shù)HCC患者在免疫檢查點阻斷后都表現(xiàn)出耐藥性或復發(fā)，這與患者體內(nèi)腫瘤免疫微環(huán)境向腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成相關(guān)。而腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成與先天性免疫和適應性免疫的功能失調(diào)相關(guān)。因此重新塑造免疫微環(huán)境成為晚期HCC患者的治療策略。但不同細胞如何調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，使其發(fā)展為對免疫治療產(chǎn)生耐藥的具體機制仍不清楚。

烈冰生物合作伙伴海軍軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院衛(wèi)立辛、吳東團隊與復旦大學周兆才、焦石團隊針對上述問題開展了系列研究，于近期在 Journal of Hepatology 期刊發(fā)表了題為Immunosuppressive CD10+ALPL+ neutrophils promote resistance to anti-PD-1 therapy in HCC by mediating irreversible exhaustion of T cells 的研究論文。烈冰生物參與了本研究中的單細胞測序和數(shù)據(jù)分析工作。

下面我們一起了解一下本文的研究思路和數(shù)據(jù)分析過程~

一、實驗設(shè)計

1 HCC患者：

樣本：抗PD-1治療響應的HCC患者（n=3），抗PD-1治療耐藥的HCC患者（n=4）

采樣組織：腫瘤組織

單細胞捕獲平臺：BD Rhapsody

2 動物模型：

樣本：二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）誘導的HCC大鼠 （n=6）

采樣組織：腫瘤、鄰近肝組織、骨髓、外周血、門脈虛血、脾臟

單細胞捕獲平臺：10X Genomics

主要技術(shù)：單細胞測序（scRNA-seq）、流式細胞術(shù)、免疫熒光、蛋白質(zhì)質(zhì)譜、基因敲除等

Novelbrain云平臺分析工具：

細胞聚類分析、擬時序分析、速率分析、差異基因表達分析、轉(zhuǎn)錄因子分析（SCENIC）、GSEA基因富集分析、InferCNV等

二、研究結(jié)果解析

01 單細胞測序初步分析與細胞類型確認

研究者對7例計劃進行抗PD-1治療的肝細胞癌患者活檢組織進行了單細胞測序，根據(jù)mRECIST標準，將患者分為抗PD -1敏感組和抗PD -1耐藥組，通過scRNA-seq來評估免疫、腫瘤和基質(zhì)細胞的特性。為了保證后續(xù)分析的可靠性，研究者與烈冰的生信團隊對數(shù)據(jù)進行嚴格的質(zhì)控，最終得到31,672個細胞。通過細胞聚類分析，共鑒定出7個細胞大類，并使用CNV分析，對腫瘤細胞進行惡性評分。

通過對不同樣本和分組的細胞類型進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)耐藥組中的中性粒細胞占比明顯低于響應組，而巨噬細胞占比則明顯高于響應組。

02 中性粒細胞重聚類鑒定出一個獨特的NEU亞群

        考慮到中性粒細胞在兩組中出現(xiàn)明顯的占比區(qū)別，研究者將4,596個中性粒細胞（約占總細胞的14.5%）進行重聚類，得到7個亞群（NEU1-NEU7）。其中，NEU1主要存在于耐藥組中，高表達免疫抑制的基因，富集抑制免疫功能的通路，且高表達JAML和CD170兩個顯著代表前體中性粒細胞免疫抑制功能的基因；而NEU3–6亞群表主要表達抗腫瘤免疫的基因，且PDL1在NEU3和NEU4中特異性富集。

為了研究NEU1細胞和其他細胞群體之間關(guān)系，研究人員進行了速率分析和擬時序分析，發(fā)現(xiàn)NEU1 群體位于發(fā)育的起點，且特異性表達CD10、ALPL、JAML基因。因此將NEU1細胞群體命名為CD10+ALPL+ NEU。

        以上結(jié)果確定了不同的中性粒細胞亞群，其獨特的分布模式與HCC患者免疫治療的療效相關(guān)，并進一步表明NEU1可能是一種潛在的免疫抑制群體，是患者產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵。

03 不同亞群的耗竭T細胞對抗PD-1治療的反應

        耗竭性T細胞（TEX）已被確定為抗PD -1治療的主要靶點，參與腫瘤進展和免疫逃逸。為了表征TEX細胞在不同抗PD -1反應中的作用，研究人員從7例患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)中提取了T細胞的信息。根據(jù)TEX細胞在敏感組和耐藥組的分布，將TEX細胞分為三個亞群：TEX Sensitive （TEX^S，主要分布在敏感組)細胞、TEX Resistant （TEX^R，主要分布在耐藥組)細胞和TEX^S&R（均勻分布在兩組）細胞。對TEX^R細胞和TEX^S細胞進行功能分析，發(fā)現(xiàn)TEX^R細胞主要富集免疫抑制的通路上，TEX^S細胞主要富集在免疫激活的通路上。

        通過進行SCENIC分析，研究人員進一步比較了敏感組和耐藥組轉(zhuǎn)錄因子的活性，發(fā)現(xiàn)TEX^S細胞中明顯豐富的EOMES活性，據(jù)報道，EOMES可介導耗竭T細胞分化和持續(xù)的T細胞衰竭。表明抗PD -1耐藥患者的TEX^R細胞可能處于衰竭狀態(tài)，且這種耗竭是不可逆的。

04 CD10+ALPL+ NEUs促進T細胞的不可逆耗竭

為了深入了解CD10+ALPL+ NEUs與T細胞之間的調(diào)控關(guān)系，研究人員進行了細胞-細胞相互作用分析(CellPhoneDB)。結(jié)果表明，耐藥患者中分析到CD10+ALPL+ NEUs和TEX細胞之間的相互作用是敏感組的兩倍。

05 腫瘤細胞將中性粒細胞轉(zhuǎn)化為免疫抑制性CD10+ALPL+ NEUs

總的來說，腫瘤細胞通過NAMPT-NTRK1信號通路對CD10+ALPL+ NEUs進行重編程，維持未成熟狀態(tài)，抑制CD10+ALPL+ NEUs的成熟和激活，而CD10+ALPL+ NEUs使T細胞處于不可逆的耗竭狀態(tài)，導致了患者產(chǎn)生耐藥性。

三、總結(jié)

本研究采用單細胞測序技術(shù)（scRNA-seq），通過比較分析和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)在HCC患者中存在一個與抗PD-1治療的耐藥性相關(guān)的CD10+ALPL+ 中性粒群體，并進一步發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞通過NAMPT-NTRK1信號通路對CD10+ALPL+ NEUs進行重編程。

    研究結(jié)果揭示了CD10+ ALPL+中性粒細胞使抗PD-1治療產(chǎn)生耐藥的機制，也為新的免疫治療靶點和可能的協(xié)同治療方案提供了進一步的見解。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.jhep.2023.08.024