Single Cell Sequencing技術(shù)，即利用優(yōu)化后的高通量測序技術(shù)（NGS，Next Generation Sequencing）分析每一個單個細(xì)胞的序列信息，從而更高分辨率地揭示細(xì)胞間的細(xì)胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況。
那么問題就來了：
1. 如何獲得單個細(xì)胞？如果無法獲得單個細(xì)胞這一切都是不成立的。
2. 如何獲得大批量 的單個細(xì)胞？單組織細(xì)胞群體在10E6以上，如果被檢測的測序細(xì)胞數(shù)量過小精確度不足。
3. 如何低成本地獲得大批量單個細(xì)胞？單細(xì)胞測序成本非常高，尤其是需要測2000~3000個以上的細(xì)胞的時候，如果單個細(xì)胞的分選成本也很高，技術(shù)根本無法普及。
      所以，正因為這些問題的存在使得高通量測序在單個細(xì)胞測序應(yīng)用中的普及度一直不足，直到幾個革命性技術(shù)的誕生。

      從上圖中我們可以看到，2010年-2014年之間，單細(xì)胞測序領(lǐng)域采用的主流技術(shù)的細(xì)胞通量都在100以內(nèi)，哪怕是最為先進(jìn)的Fluidigm C1平臺也是如此。因此我們在2014-2016年間看到的大量Single-Cell Seq的高分文章的單個細(xì)胞測序數(shù)量一般都在1000以內(nèi)，因為這1000個細(xì)胞代價極大。
      Fluidigm C1平臺，是最早被應(yīng)用于Single Cell領(lǐng)域的商業(yè)化分選技術(shù)，基于富魯達(dá)（Fluidigm®）的微流控技術(shù)，大約在幾個小時中可以捕獲96個左右的細(xì)胞，進(jìn)行各類的Single-Cell測序建庫。當(dāng)然，通量還是比較小。但不可否認(rèn)的是，現(xiàn)在很多非RNA類Single Cell測序，仍然在采用這樣的技術(shù)，如Single Cell DNA-Seq，Single Cell ATAC-Seq等，都是采用此技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分選后再分別用不同試劑盒建庫。所以可以說，至少在10X和BD，或者其他企業(yè)推出有效的Single DNA測序技術(shù)之前，C1仍然會是市場上的重要組成部分。

引用自：http://cn.fluidigm.com/products/c1-system

      令人亢奮的是，在2014-2015年間幾個革命性技術(shù)誕生了，仿佛寒武紀(jì)大爆發(fā)一般，MARS-Seq、CytoSeq、Drop-Seq、inDrop技術(shù)在這兩年中扎堆出現(xiàn)，真正引爆了Single-Cell這個領(lǐng)域。而在2017-2018年，商業(yè)化的測序平臺（10X Genomics®, BD Rhapsody®），逐漸浮出水面，才最終讓Single-Cell測序技術(shù)走進(jìn)了民用市場。

10X Genomics

BD Rhapsody

      從成本上來說，基于C1類的捕獲技術(shù)的代價非常大，單細(xì)胞捕獲成本在9-30美元不等，而且這還是一個沒有關(guān)稅、沒有代理商加價的價格。2000-3000細(xì)胞需要18000-100000美元不等的捕獲費(fèi)用，可以說非壕不可用的技術(shù)。因此烈小冰暫時就不做詳細(xì)講解了。

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.

      烈小冰主要講講兩個現(xiàn)在的主流技術(shù)，BD Rhapsody以及10X Genomics。從誕生年代來看，兩者不分伯仲，10X Genomics起源自Drop-Seq技術(shù)，得益于哈佛大學(xué)的研究所的工作。

從Drop-Seq技術(shù)到10X Genomics技術(shù)

      BD的Rhapsody平臺，最早可以追溯到2015年Single Cell Cytoseq技術(shù)，可以說是完全同時代的技術(shù)。2017年BD也攜一篇研究腦神經(jīng)的Nature Article將該商業(yè)化技術(shù)發(fā)布了。（Birey F, Andersen J, Makinson C D, et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids[J]. Nature, 2017, 545(7652): 54.）

       10X Genomics和Drop-Seq具有類似的技術(shù)原理。從橫向孔道中逐一輸入凝膠微珠，第一縱向孔道輸入細(xì)胞，凝膠微珠與細(xì)胞碰撞后會吸附在凝膠微珠上，并通過微流控技術(shù)，將之輸入到第二縱向孔道，即油相孔道中。這時候，就形成了一個個油滴，最終輸出并收集在EP管中。每一個油滴中會落入一個細(xì)胞以及一個凝膠微珠，那么在每一個凝膠微珠中上長滿了不同的Cell Barcode和UMI Barcode連接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，構(gòu)成我們的捕獲凝膠微珠。而這個凝膠微珠抓手就會使用oligo dT抓住mRNA構(gòu)建文庫。

10X Genomics凝膠微珠設(shè)計

      所以一個油滴=一個單細(xì)胞=一個凝膠微珠=一個RNA-Seq，可以說這就是10X的基本技術(shù)原理。
      然而市場并不只有一家Single Cell的商業(yè)化捕獲平臺，另外還有BD這個老牌的抗體巨頭的Rhapsody平臺。這個平臺又是依托什么技術(shù)，和10X Genomics技術(shù)存在什么區(qū)別呢？
      BD的技術(shù)不再采用利用微流控孔道射出細(xì)胞和射出的磁珠碰撞的過程，進(jìn)行單細(xì)胞捕獲的技術(shù)，轉(zhuǎn)而采用CytoSeq特有的蜂窩板技術(shù)。該技術(shù)用20W+的微孔（該數(shù)量級遠(yuǎn)大于Input細(xì)胞數(shù)量），保證單孔中的單細(xì)胞捕獲。同時避免了10X中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題，采用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率（來自兩家企業(yè)商業(yè)宣傳資料比對），保證Input細(xì)胞的全面使用。對于Input細(xì)胞的量更少的情況，可以基于10E5的細(xì)胞總量開始進(jìn)行前期處理以及后期捕獲操作。（烈小冰在之前的實驗技術(shù)分享里提到過 Single Cell前處理會丟失一些細(xì)胞哦?。?而在細(xì)胞捕獲完成后，進(jìn)行細(xì)胞裂解后，同樣的也進(jìn)行細(xì)胞中RNA polyA序列的抓取工作。

BD Rhapsody 單細(xì)胞mRNA抓取過程

      所以一個微孔=一個單細(xì)胞=一個磁珠=一個RNA-Seq，可以說這就是BD的基本技術(shù)原理。
      從現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，我們很難比較兩種技術(shù)的優(yōu)劣，但是從現(xiàn)有的文章發(fā)表情況來看，兩種技術(shù)都在主流高IF期刊上有可信的數(shù)據(jù)發(fā)表，并且都與Smart-Seq數(shù)據(jù)的結(jié)果存在比較，因此兩種技術(shù)都是可用可信的大規(guī)模Single Cell RNA-Seq技術(shù)。從發(fā)布時間來看，10X發(fā)布更早，而BD發(fā)布在其1年之后，這點上10X Genomics的設(shè)備稍占優(yōu)勢。而在捕獲效率和有效性來看，BD Rhapsody的捕獲效率更高較占優(yōu)勢。
      從技術(shù)原理上分析兩種Single Cell測序技術(shù)，都是基于UMI（Unique Molecular Identifier）+ CL（Cell Label）的技術(shù)，與傳統(tǒng)Smart-Seq + Fluidigm的C1技術(shù)比較起來，引入UMI技術(shù)（這個我們會在分析部分簡單介紹）進(jìn)行表達(dá)定量，使得大規(guī)模scRNA-Seq的基因表達(dá)定量結(jié)果幾乎不會受到PCR Bias影響，從而更準(zhǔn)確。

圖注：如果一個基因具有序列一致的UMI序列的測序Reads，那么這條Reads其實PCR Bias

相對于Smart-Seq技術(shù)在細(xì)胞數(shù)量上的問題，BD和10X這兩個平臺普遍提供的細(xì)胞數(shù)量都在1-6K不等的測序細(xì)胞量，這個量級的測序細(xì)胞量已經(jīng)可以說能夠完全覆蓋絕大部分組織的Single Cell群體類型。因此，這兩種技術(shù)對于基于基因表達(dá)進(jìn)行準(zhǔn)確細(xì)胞分型上，無論是從細(xì)胞數(shù)量上來說還是表達(dá)檢測可靠性來說，都會更實用。同時依托Random Cell Label技術(shù)，使得其對于NovaSeq、HiSeq X Ten、Hiseq 4000等設(shè)備存在的Index hooping現(xiàn)象，相對于Smart-Seq數(shù)據(jù)來說，影響幾乎可以忽略不計（10X Genomics官方網(wǎng)站曾給出hooping測試結(jié)果，顯示無影響。https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/115002052846-Index-hopping-on-the-HiSeq-4000-and-its-effect-on-10x-Single-Cell-libraries）。

Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods[J]. Molecular cell, 2017, 65(4): 631-643. e4.